重组高拷贝酵母

重组高拷贝酵母#

1. 酵母多拷贝菌株筛选#

毕赤酵母（Pichia pastoris）

1.1. YPD 平板#

准备：平板、5 mL 枪头、遗传霉素 G418（500 mg/mL，现配 3 mL，过膜）

  1. 蛋白胨 2%，酵母粉 1%（分别加 8 g，4 g 配 400 mL，16 个板，1 个梯度 2 个板）

  2. TYA 分装 4 瓶，每瓶 90 mL，装于 250 mL 三角瓶，分别加琼脂 2 g

  3. 葡萄糖 2%（10 g 配 50 mL，单独灭菌）

  4. 超净台中 90 mL TYA + 10 mL 葡萄糖（每瓶倒 4 个板）

  5. 待冷却至微烫（不可使之接近室温），迅速加入遗传霉素 G418 倒板

  6. 每 100 mL 分别加入 400，600，800，1000 μL，即终浓度为 2∼5 mg/mL（200 μL 为 1 个梯度单位）

  7. YPD 平板于超净台放置 1 天后，准备灭菌甘油（30%）、灭菌 EP 管、灭菌刮子

  8. 取 1 mL 无菌水于 His⁺ 转化子平板

  9. 灭菌刮子重悬后，抽取加入 1.5 mL 离心管中

  10. 3∼5 mg/mL 平板 每板加入 200 μL，涂匀，剩余菌液甘油保藏

1.2. BMGY 摇瓶#

准备：Pichia pastoris 储备液、灭菌牙签、5 mL 枪头、50 mL 三角瓶（16∼20 个）

  1. 蛋白胨 2 g，酵母粉 1 g，水 70 mL

  2. 1 M pH 6.0 PB，13.4% 无氨基酵母氮源（YNB），10% 甘油，各加 10 mL

  3. 0.02% 生物素 200 μL

  4. 分装入 50 mL 三角瓶，每瓶 5 mL

1.3. BMMY 摇瓶#

  1. 蛋白胨 4 g，酵母粉 2 g，水 140 mL

  2. 1 M pH 6.0 PB，13.4% 无氨基酵母氮源（YNB），10% 甲醇，各加 10 mL

  3. 0.02% 生物素 200 μL

  4. 分装入 100 mL 三角瓶，每瓶 10 mL

  5. 灭 1.5 mL 离心管，40% 甘油，5 mL 枪头

1.4. 发酵#

  1. 牙签法挑取 YPD 平板上较大的单菌落接种于 BMGY 摇瓶，30°C，> 24 h

  2. 向每瓶 BMMY 中接种 1 mL BMGY，另各取 800 μL + 800 μL 甘油保藏

  3. 此后 4 天每天每瓶补加甲醇 50 μL

1.5. 离心测酶活#

2. 高密度发酵#

2.1. 发酵罐培养基#

试剂

配方 1

配方 2

H₃PO₄

26.7 mL

40.05 mL

甘油

40 g

60 g

CaSO₄

0.93 g

1.395 g

K₂SO₄

18.2g

27.3 g

MgSO₄·7H₂O

14.9 g

22.35 g

KOH

4.13 g

6.195 g

补水

To 1∼0.1 L

To 1.5∼0.15 L

2.2. 罐体灭菌#

  1. 发酵培养基用量筒定容，倒入发酵罐，密封好，排气孔勿封死。

  2. 校正溶氧电极：把帽子拧下，向电极内滴加 3 滴电极保护液，连接主机，插入无水亚硫酸钠饱和溶液，返回主界面 F3 标定，待测量值 < 2% 并稳定，CTRL + F2。

  3. 校正 pH 电极：连接主机，返回主界面 F3 标定，将电极插入 pH 7.0 校正液，稳定后 CTRL + F2，冲干净后，插入 pH 4.0 校正液，稳定后 CTRL + F3。

  4. 4 个补料瓶（带夹子）：甲醇（空瓶）、氨水（空瓶）、甘油（质量分数 50%，200 mL），消泡剂，一端连好罐体，一端夹住灭菌。

  5. 2 个电极：pH 电极，溶氧电极拧好。

  6. 通气管（带空气滤膜）按滤膜方向连在前管扣，排气管连在后口，两端夹子夹好。

  7. 勿关机。

2.3. 接种前准备#

  1. 预先培养上罐体积 10% 种子液（YPD 摇瓶）150 mL/1.5 L，过夜。

  2. 接种前，超净台加营养盐 PTM1:50% 甘油 2.4 mL/0.2 L，无水甲醇 12 mL/L，种子液 6.535 mL/1.5 L

注：

  • 不要在 pH 调到 5 以后再加 PTM1，灭完就加。

  • 发酵培养基在 pH > 6.5 时会产生乳白色混浊状，发酵时 pH 控制 < 6，若产生沉淀，用磷酸调节就行。

2.4. 装罐顺序#

  • 连通气管至发酵罐

  • 开压缩机风机开关

  • 开压机开关

  • 接冷凝水（左边两罐连于底座，右边两管带水阀的接下面，为进水管，另一接上面，为出水管

  • 接电极（pH，溶氧，温度）

  • 调温度为自动控制

  • 调 pH 为 4.0，自动控制

  • 待稳定后，校正溶氧电极为 100%，CTRL + F3

  • 开转轴（200、400、600

  • 钢圈 + 酒精棉点火接种（酒精不宜太多，铝箔围好）

  • ALT + F1 解锁

  • ENTER

2.5. 补料发酵#

  1. 转速 600 rpm，18∼24 h，耗尽甘油，即溶氧由 0 回升，流加 50% 甘油（去夹子）（补料调为自动）。

  2. 转速 750 rpm，开始补料，速度由 50 s/次增加，根据实际溶氧值调整，保持溶氧 > 20%，pH 调至 5.0，流加 4 h。

  3. OD₆₀₀ = 180∼200 时（稀释 1000 倍），饥饿 30 min，pH 调至 6.0

  4. 流加甲醇（去夹子），由 120 s/次逐渐提升，保持溶氧 >20%，每隔 12 h 取样。

2.6. 检测#

  1. 菌体湿重（2 次平行），OD₆₀₀（稀释 1000 倍）

  2. 酶活，总蛋白量

  • 卸罐

逐渐降低转速至 0，补料速度调为 0，调温度及 pH 为手动并关闭开关。

  • QSFF 柱纯化

  1. 离心取上清，透析过夜。

  2. Q 柱先用 1 M NaCl 洗，后用 0.5 M NaOH 再生。

  3. 缓冲液平衡后上样。

  4. 缓冲液 + 0.5 M NaCl 梯度洗脱。

3. 真菌基因组 RNA 的提取#

3.1. 培养（100 mL/样）#

KH₂PO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.02 g KCl 0.01 g, CaCl₂ 0.01 g

蛋白胨 1%，诱导碳源 2∼3%（至少 3 种：几丁质，玉米芯，燕麦粉）

3.2. 准备#

  • 全新氯仿、异戊醇、水饱和酚、异丙醇、无水乙醇，Trizol

  • 无 RNase 枪头（蓝、黄、白各一盒），Axygen PCR 管（灭菌、烘干），Axygen 1.5 mL EP 管

  • 液氮，研钵、药匙、镊子（200°C，烘干）

  • Takara：无 RNase 水，10× DNase I Buffer，Recombinant DNase I，RNase Inhibiter 1.5 mL

  • 离心管处理：1‰ DEPC 水，37°C，搅拌 12 h，加入离心管搅打过夜，甩干后高压灭菌，80°C 烘干

  • 超净台：提前清理，灭菌

3.3. 均质#

超净台中尽量避免手臂在 EP 管上方

  1. 抽滤菌体，尽量抽干，由滤纸按压吸干，放入研钵，加入液氮研磨至无颗粒

  2. EP 管中先加入 1 mL Trizol，每个样品做 6 管，加入 1 小药匙研磨好的菌体，充分震荡

  3. 样品在 15∼30°C，放置 5 min，使核酸-蛋白复合物完全分离

3.4. 相分离#

  1. 每用 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿，震荡 15 s，室温放置 3 min（粉红色）

  2. 震荡后离心：4°C，1,2000 rpm，15 min，分 3 层：有机相，中间层，无色水相（RNA 主要在水相）

3.5. RNA 沉淀#

  1. 把水相转移至新管中，用等体积酚（氯仿异戊醇）抽提（各 300 μL），重复 5∼8 次，至中间层最少

  2. 加入等体积异丙醇（300∼350 μL），震荡，15∼30°C，放置 10 min

  3. 离心：4°C，1,2000 rpm，10 min，去上清

3.6. RNA 洗涤与重悬#

  1. 用 75% 乙醇（无 RNase 水现配）洗涤沉淀，每管至少加入 200 μL 75% 乙醇，重悬沉淀

  2. 离心：1,2000 rpm，5 min

  3. 去上清，室温吹干液体

3.7. 电泳验证#

3.8. 除 DNA#

反应体系 50 μL，每 6 管配无 RNase 水 297.5 μL，其他 35，14，3.5 μL，后分装

  1. 每管加入 42.5 μL 无 RNase 水溶解 RNA 沉淀

  2. 每管再加入 10× DNase I Buffer 5 μL

体积

Recombinant DNase I

2 μL

RNase Inhibiter

0.5 μL

  1. 37°C，水浴 20-30 min

3.9. 再萃取#

无水乙醇提前 4°C 预冷

  1. 用 50 μL 无 RNase 水定容至 100 μL

  2. 加入等体积酚（氯仿\异戊醇）各 50 μL

  3. 离心：1,2000 rpm，5 min，取上清，重复 2 次

  4. 每管加入 10 μL 3 M NaAc（DEPC 水配制）和 250 μL 无水乙醇（4°C 预冷），-20°C，20 min

  5. 离心：4°C，1,2000 rpm，10 min，去上清

  6. 用 75% 乙醇（4°C 预冷，无 RNase 水现配）洗涤沉淀，每管至少加入 200 μL 75% 乙醇，重悬沉淀

  7. 离心：1,2000 rpm，5 min，去清液，吹干液体，

  8. 室温干燥 RNA 5∼10 min，40 μL 无 RNase 水溶解（6 管混在一起），-80°C 保存

4. mRNA 纯化#

4.1. 探针退火#

  1. 在无 RNaseD 1.5 mL 离心管中，加入 0.1∼1 mg 总 RNA，加入无 RNase 水至 500 mL（可分为 2 管做）

  2. 将上述离心管 65°C，水浴 10 min

  3. 加 1.5 μL oligo-dT 和 6.5 μL 20× SSC 进上管，轻轻混匀，室温放置 10-20 min 至完全冷却

4.2. 准备贮备液#

20 × SSC

DEPC 水

体系

0.5 × SSC

30 μL

1.17 mL

1.2 mL

0.1 × SSC

7 μL

1.393 mL

1.4 mL

4.3. 洗涤磁珠#

  1. 轻打磁珠底部至磁球完全分开，放至磁架上吸附磁珠

  2. 仔细吸出液体

  3. 300 μL 0.5×SSC 洗涤 3 次

  4. 100 μL 0.5×SSC 重悬，分 2 管

4.4. 提取 mRNA-oligo (dT) 复合物#

  1. 将总 RNA 加入洗涤过的磁珠管中

  2. 室温 10 min，每隔 1∼2 min 上下颠倒混匀

  3. 除上液体

  4. 用 0.1×SSC（每次 300 μL）洗涤磁珠 4 次，轻打底物至无结块（最后一次尽可能多除去液体）

4.5. 洗脱 mRNA#

  1. 100 μL DEPC 水重悬磁珠，轻打试管

  2. 150 μL 无 RNase 水重悬磁珠将液体转移至无 RNase 的试管中

  3. 每管 50 μL 水洗，洗 2 次

5. cDNA 的反转录合成#

5.1. RNA Primer 混合物#

PCR 管中，20 μL

体积

Oligo dT primer（Random Primer, 50 pmol）

2 μL

dNTP Mix (10 mM)

2 μL

Template RNA（RNase free d H₂O 复溶）

16 μL

65°C，5 min，冰上急冷

5.2. PCR#

第一链，40 μL

体积

Template RNA Primer mixture（即上步反应液）

20 μL

5×PrimeScript Buffer

8 μL

RNase Inhibitor （40 U/mL）

1 μL

PrimeScript Reverse Transcriptase （200 U/mL）

1 μL

RNase free d H₂O 10 μL

5.3. PCR 程序#

反应液轻轻混匀

  1. 随机引物：30°C，10 min（预先单独反应）

  2. 所有混合液

温度

时间

Step 1

42°C

30~60 min（特异性下游引物用 50°C）

Step 2

70°C

15 min

Step 3

4°C

10 min

6. 培养基#

6.1. PDA 培养基（g/L）#

马铃薯 200 g 切丁放入烧杯，加入 1 L 水，煮沸，纱布过滤，外加葡萄糖 20 g 和琼脂 20 g。

7. 试剂#

7.1. 发酵储备液#

  1. 10× YNB（13.4%）：134 g YNB 用去离子水定容至 1000 mL，无菌过滤后 4°C 保存

  2. 10× M（5% 甲醇）：5 mL 甲醇与 95 mL 水混匀，无菌过滤，4°C 保存

  3. 10× GY（10% 甘油）：100 mL 甘油与 900 mL 水混匀，121°C，15 min，常温

  4. 1M pH 6.0 PB：900 mL 1 M NaH₂PO₄，不断加入 1 M Na₂HPO₄，至 pH 达到 6.0，121°C，15 min

  5. 500× B（0.02% 生物素）：20 mg 生物素定容至 100 mL，无菌过滤，4°C 保存

7.2. PTM1 配方（定容至 1L）#

  • CuSO₄·H₂O 6.0 g，MnSO₄·H₂O 3.0 g，FeSO₄·7H₂O 65.0 g

  • CoCl₂ 0.5 g，ZnCl₂ 20.0 g，H₃BO₃ 0.02

  • NaI 0.08 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2 g

  • D-生物素 0.2 g，H₂SO₄ 5 mL

注：PTM1 配制中，一定要按顺序每样成分依次溶解，最后加硫酸，整个过程搅拌不要停止，最后呈浅绿色。

8. 毕赤酵母#

8.1. 宿主菌#

目前常用的毕赤酵母几乎都是组氨酸脱氢酶基因（his4）的突变株，因此 his4 基因是主要选择标记基因。

  • 具有醇氧化酶 AOX 基因启动子，为已知最强、调控机制最严格的启动子之一；

  • 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝形式稳定整合；

  • 存在过氧化物酶体，表达蛋白储存其中可免受蛋白酶降解，且减少对细胞的毒害。

菌株

基因型

表现型

Y11430

wild-type

Mut⁺His⁺

GS115

his4

Mut⁺His⁻

KM71

aox1Δ::SARG4、his4arg4

Mut⁻His⁻

MC100-3

aox1Δ::SARG4、aox2Δ::Phix4、his4arg4

MutˢHis⁻

SMD1168

pep4Δhis4

Mut⁺His⁻ 蛋白酶缺陷

SMD1165

pbr1his4

Mut⁺His⁻ 蛋白酶缺陷

SMD1163

pep4pbr1his4

Mut⁺His⁻ 蛋白酶缺陷

  • Mut⁺：甲醇利用快型

  • Mutˢ：甲醇利用慢型

  • Mut⁻：不能利用甲醇型

8.2. 重组（Recombination）#

毕赤酵母无天然质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将目的基因表达框架整合于染色体中以实现目的基因的表达，即为整合型载体。部分表达载体分泌胞外蛋白，在 N 端有一段信号肽，引导目的蛋白进入分泌途径，分泌效率高的多为酿酒酵母 α 因子前导肽序列。

载体

标记

启动子

特性

pA0815

his4

AOX1

多拷贝载体

pHILD2

his4

AOX1

NotI 切割进行重组

pHILS1

his4

AOX1

使用 PHO1 分泌信号

pPIC3

his4

AOX1

pPIC9

his4

AOX1

使用 α 因子前导肽序列

pHW010

his4

GAP

组成型启动子。

pPICZ(α)

bleʳ

AOX1

α：使用 α 因子前导肽序列，多拷贝，含 His 标签和 myc 表原标记

pGAPZ(α)

bleʳ

GAP

α：使用 α 因子前导肽序列，多拷贝，含组氨酸标签和 myc 表原标记；组成型启动子

8.3. 酵母菌株的分离纯化#

  1. 接种 KM71 于 5 mL YPD 中；

  2. 30°C、250∼300 r/min 振荡过夜；

  3. 涂布 YPD，30°C 培养；

  4. 用 YNB 基本培养基和含 His 的补充培养基接种，挑选在补充培养基上生长而在基本培养基上不生长的单菌落，划线 YPD 平板，4°C 保存。

8.4. 电转化#

  1. 挑取酵母单菌落，培养种子液，接种至大瓶 YPD，培养至 OD₆₀₀ = 1.3∼1.5，收集菌体。

  2. 500 mL 预冷无菌水重悬，离心收集菌体。

  3. 250 mL 预冷 1 M 山梨醇重悬，离心收集菌体。

  4. 1 mL 预冷 1 M 山梨醇重悬，分装至 40 μL/份，备用。-20°C 可保存 2 周。

  5. 将 1 μg 线性化重组 DNA 溶解于 5 μL TE 溶液中，与上步菌体混匀。

  6. 转移 0.2 cm 预冷转化杯中，冰浴 5 min。

  7. 擦拭杯面水分，装入电转化仪。加脉冲电压：电压 1.5 kV、电阻 200 Ω、电容 25 μF、电击 5 ms。

  8. 加入 1 mL 1 M 预冷山梨醇于电极池内，混匀，转移至 1.5 mL。

  9. 将菌体悬液涂布于 MD 平板上，每 200∼600 μL 涂布平板，平板于 30°C 培养。

8.5. PCR 法筛选重组子#

  1. 牙签法挑取单菌落。

  2. 在盛有 10 μL 无菌水的 PCR 管中涮洗一下，再在贴有标签纸的平板的某个编号对应培养基上插一下。

  3. 在每管中加入 PCR 反应液，PCR 扩增后，取 5 μL 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。

Issues

Volume (μL)

PCR

water 3.9

10× buffer

2.0

25 M MgCl₂

1.2

2.5 M Dntp

1.6

Primers

0.6×2

Taq 酶

0.1

8.6. 毕赤酵母基因组的提取#

  1. 接种重组和空质粒转化子于 5 mL YPD 培养基，30°C，16~18 h。

  2. 收集菌体，100 μL TE（pH 7.0）重悬。

  3. 加入 300 μL EDTA（pH 8.0）、0.07 M Tris·HCl、3 μL β-巯基乙醇、1 mg 溶菌酶。

  4. 37°C 水浴，10,000 g 离心 10 min，去上清，加 90 μL TE 重悬沉淀。

  5. 加 200 μL 饱和酚、200 μL 氯仿，混匀后 10,000 g，离心 30 s。

  6. 取上层水相，加 2 倍体积无水乙醇及 1/10 体积 NaAc，-20°C 静置 30 min。

  7. 离心去上清，75% 无水乙醇漂洗沉淀一次。

  8. 干燥，沉淀溶于 15 μL TE 或双蒸水中，-20°C 保存备用。