基因工程

基因工程#

2. 细菌 DNA 的提取#

2.1. 关于 16S rDNA#

rRNA 分子在生物体中普遍存在，其一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列，在结构上可分为保守区（conserved domain）和可变区（variable domain）。保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异。研究 rRNA 基因序列可以发现各物种间的系统发生（phylogenesis）关系。细菌 rRNA 按沉降系数分为 3 种，分别为 5S、16S 和 23S rRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的 16S rRNA 长约 1540 bp，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进行序列测定和分析比较。16S rDNA 是细菌染色体上编码 16S rRNA 相对应的 DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。因此可用 PCR 扩增其相应的 rDNA 片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。

2.2. 原理#

基因工程实验所需要的基因组 DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的 DNA 非易事。对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁。提取难度将大于真核细胞。同时有染色体 DNA 和质粒 DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体 DNA 缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒 DNA 则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体 DNA。

细菌基因组 DNA 在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断 DNA，若要抽提到大的 DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力；分子热运动也会减少所抽提到的 DNA 分子量，故提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的 DNA，故制备过程要抑制其核酸酶的活性。

制备的 DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有 RNA，各种离子浓度应符合要求。DNA 不溶于 95% 的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的 DNA。并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使 DNA 携带的盐离子。

大肠杆菌染色体 DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂 SDS 破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；
解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体 DNA 上的蛋白质；
SDS 能与蛋白质结合成为 R₁-O∼SO₃R₂-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

SDS 也能抑制核糖核酸酶的作用，故在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步 RNase 的作用。破细胞后 RNA 经 RNase 消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿-异戊醇抽提除去。含有质粒 DNA 的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收 DNA。

2.3. 材料#

LB 液体培养液
酚/氯仿（1:1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点 160°C 部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，-20°C 密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68°C 蒸馏水饱和，加入 8-羟基喹啉（100g 酚加 0.1g），酚变为黄色。8-羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含 8-羟基喹啉的酚用等体积 1.0 > M pH 8.0 Tris 缓冲液抽提，再用 0.1 M pH 8.0 含 0.2％ > β-巯基乙醇的 Tris 缓冲液抽提数次，酚溶液的 pH 应 > 7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下 4°C 可保存一个月。
核糖核酸酶：无 DNase 污染，将胰 RNase（RNase A）溶于 10 mM Tris·Cl（pH > 7.5） + 15 mM Nacl 溶液中，浓度为 10 mg/mL 于 100°C 加热 15 min，缓慢冷却至室温，分装后于 -20°C 保存。
TEG 缓冲液：pH 8.0 25 mM Tris⋅HCl，10 mM EDTA，50 mM 葡萄糖，4 mg/mL 溶菌酶
碱裂解液：0.2 M NaOH，1% SDS
乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。

2.4. 方法与步骤#

取 1 mL 对数期菌液，12000 rpm 5 min；
弃上清，将沉淀溶于 200 μL 丙酮，震荡混匀，冰浴 5 min。
8000 rpm 离心 2 min，弃上清。
将沉淀混于 TEG 缓冲液中，震荡混匀，冰浴 5 min
加入 200 μL SDS 裂解液，冰浴 5 min
加入 150 μL 乙酸钾溶液，冰浴 15 min，使其沉淀完全。
4°C 下离心，12000 rpm，5 min。（乙酸钾能沉淀 SDS 与蛋白质的复合物，并使过量的 SDS-Na⁺ 转化为溶解度很低的 SDS-K⁺ 一起沉淀下来。）离心后，若上清液浑浊，应混匀后再冷至 0°C，重复离心。弃去上清
加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000 rpm 2 min（可多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀）。
将上清移至新管，加入 2 倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。
-20°C，15 min 后，4°C 下离心 12000 rpm 5 min。
1 mL 70% 冷乙醇洗涤沉淀，然后离心，弃去上清液。
干燥，100 μL 20 μg/mL RNase A，37C，30min
2 倍体积无水乙醇沉淀，70% 冷乙醇洗涤（沉淀 DNA 可以使用一倍体积异丙醇或 2 倍体积乙醇。）
干燥，溶于 50 μL TE（倒数一二步是制备的 DNA 马上就要用的情况，若需保存，则是在使用之前加入 RNase。）

革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取 CTAB/NaCl 法稍加修改，在第四步加入终浓度 2 mg/mL 的溶菌酶，37 度温育 1h。

2.5. 实验注意#

提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤 DNA。
菌量有一定的要求，通常为菌液的 OD₆₀₀=1.9 时，取 1∼2 mL 就可以了。
第一步悬浮时，振荡的时间稍长一些（1∼2 min），充分悬浮菌体。
裂解步骤中，若不澄清说明菌体没有裂解，可能的原因有：a. 菌量太大；b. 该菌为厚壁的非革兰氏阴性菌。
加洗液 RNase A，量要加足，以防止清洗不净影响未来的实验。

3. 真菌基因组 DNA 的提取#

3.1. 原理#

DNA 在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB 与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

3.2. 准备#

CTAB：CTAB 4 g + NaCl 16.364 g + 1M Tris⋅HCl 20 mL（pH 8.0），冷却后 0.2∼1% β-巯基乙醇（400 μL）
氯仿-异戊醇（24:1）：先加 96 mL 氯仿，再加 4 mL 异戊醇，摇匀即可。
Tris 饱和酚

3.3. 培养#

以接种环刮取斜面上的孢子，接种至盛在 500 mL 三角瓶 100 mL PDB 培养基中，摇床 30°C，72 h。
抽滤得到菌丝体，先以 100 mL 无菌生理盐水洗涤 3 次，再以 100 mL 无菌蒸馏水洗涤 3 次。
将抽滤干的菌丝体转移至陶瓷研钵中，加入液氮，快速将菌体研磨成粉。
分装菌粉，每个 EP 管中约 100 mg。

3.4. 萃取#

准备：酚、氯仿、异戊醇

每管菌粉加入 2×CTAB 提取液 500 μL，混匀，65°C，1 h。期间不时颠倒混匀。
加入等体积的酚和（氯仿/异戊醇）（各 250 μL），12000rpm 离心 10min。
小心的吸取上清液至另一 EP 管，若有机相和水相界面处杂质较多，重复上一步至干净为止。
加入等体积的（氯仿/异戊醇），12000 rpm 离心 10 min。（量好）
加 RNA 酶溶液至浓度约 20 μg/μL，37°C 水浴 30 min。（可跳过）
加入等体积的（氯仿/异戊醇），12000 rpm 离心 10 min。（量好）
转移上清液，加入等体积的异丙醇，-20°C 放置 30 min。（量好）

3.5. 洗涤#

4°C，12000 rpm 离心 10 min，小心的吸去液体（吸净），加 1 mL -20°C，预冷 70% 乙醇，洗涤（2 次）。
4°C，12000 rpm 离心 10 min，小心的吸去液体（吸净），开盖，室温放置 15∼20 min，晾干乙醇。
加入灭菌双蒸水 50 μL，37°C，溶解 30 min，0.6% 琼脂糖凝胶电泳检测浓度。其余置于 -20°C 备用。

CTAB 提取液（2X）

称 CTAB 1 g，NaCl 4.09 g，加水 40 mL，搅拌溶解（可适当水浴加热促进溶解），加入 2.5 mL Tirs·Cl（1 M，pH 8.0），1 mL EDTA（0.5 M，pH 8.0），补水定容至 50 mL，121°C 高压蒸汽灭菌 20 min 备用。

4. PCR#

4.1. PCR 引物设计#

引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

引物长度一般在 15∼30 碱基之间

引物长度（primerlength）常用的是 18∼27 bp，但应 ⩽ 38，因为过长会导致其延伸温度 > 74°C，不适于 Taq 酶进行反应。

引物 GC 含量在 40%∼60% 之间，Tₘ 值最好接近 72°C

GC 含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tₘ 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tₘ 值 5∼10°C。若按公式 Tₘ = 4(G+C) + 2(A+T) 估计引物的 Tₘ 值，则有效引物的 Tₘ 为 55∼80°C，其 Tₘ 值最好接近 72°C 以使复性条件最佳。

引物 3’端要避开密码子的第 3 位。

如扩增编码区域，引物 3’端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物 3’端不能选择 A，最好选择 T。

引物 3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，故 3’端最好选择 T。

碱基要随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。

引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。引物间也不应具有互补性，尤其应避免 3’端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构若不可避免的话，应尽量使其 ΔG 值不要过高（应 < 4.5 kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。

引物 5’端和中间 ΔG 值应该相对较高，而 3’端 ΔG 值较低

ΔG 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，ΔG 值越大，则双链越稳定。应当选用 5’端和中间 ΔG 值相对较高，而 3’端 ΔG 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3’端的 ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的 ΔG 值可以用 Oligo 软件进行分析）

引物的 5’端可以修饰，而 3’端不可修饰

引物的 5’端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu³⁺ 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从 3’端开始的，不能进行任何修饰。3’端也不能有形成任何二级结构可能。

扩增产物的单链不能形成二级结构

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（ΔG°）< 58.6l kJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2’-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。

引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。若与其它基因不具有互补性，就可进行下一步的实验了。

4.2. RealTime PCR#

做 RealTime 时，用于 SYBRGreenI 法时的一对引物与一般 PCR 的引物在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

避免重复碱基，尤其是 G
Tₘ = 58∼60°C，GC = 30∼80%
3’端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C
正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80∼250 bp 间都可；80∼150 bp 最为合适（可以延长至 300 bp）。
引物的退火温度要高，一般要在 60°C 以上；

4.3. 其他引物#

4.3.1. 简并引物设计#

设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。
充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
应努力避免 3’端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物 3’端不要位于密码子的第三位。
在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

4.3.2. 测序引物设计#

当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，若需要自己设计的话；则除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：

测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，若引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。
测序引物的 Tₘ 值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级 DNA 聚合酶来催化，并采用 PCR 的热循环程序。选用的测序引物的 Tₘ 值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

4.3.3. 探针的设计#

探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：

探针的长短一般在 20∼50 核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。
注意 G 和 C 的含量努力控制在 40∼60％，同时一种碱基连续重复 ⩽ 4 个，以免非特异性杂交产生。
探针自身序列不能形成二聚体，也不能有”发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。
若探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在 70% 以下。

4.3.4. 巢式引物#

PCR 反应特异性低或 1 次 PCR 产量极低时使用。在第一次产物内侧设计引物 3、4，再进行 PCR，亦可与第一次引物部分重叠，甚至仅移动 3’端几个 bp。

4.4. 耐热型 DNA 聚合酶#

4.4.1. pol I 型#

用于 < 1kb 片段扩增

种类多，价格低，与 α 型酶相比，延伸活性高，重复性好，但无 3’ →5’ 外切核酸酶活性，不具校正功能，保真性一般。TA 克隆所用酶属此类。

酶	来源	特性
Taq	Thermus aquaticus	最常用的耐热聚合酶
Tth	Thermus thermophiles	Mn²⁺ 存在时，有逆转录活性，可完成”一般 RT-PCR”
Tfl	Thermus flavus	比 Taq 酶耐热
Tbr	Thermus brockiamus	比 Taq 酶耐热，且保真性好

4.4.2. α 型#

3’→5’ 外切核酸酶活性，保真性好，但延伸能力受影响，且不具有末端无模板添加碱基活性，不能用于 TA 克隆。

酶	来源	特性
Pfu	Pyrococcus furiosus	典型
Pfu Turbo	Pyrococcus furiosus	Pfu 中添加 PCR 促进因子
Pfx (KOD)	Pyrococcus kodakaraensis KOD1	具热启动特性
Pwo	Pyrococcus woesei	5’ →3’ 外切核酸酶活性完全丧失
Tli	Thermococcus litoralis	3’ →5’ 外切核酸酶活性完全丧失
DeepVent	Pyrococcus sp. GB-D	3’ →5’ 外切核酸酶活性完全丧失，极耐热
Pyrobest ™	Pyrococcus sp.	具与 Taq 酶同等延伸能力

4.4.3. 混合型#

用于 > 5kb 片段扩增，多数不能进行 TA 克隆

酶	公司	特性
LA Taq ™	TaKaRa	扩增可达 > 15kb，G-C 含量高需特殊缓冲液
EX Taq ™	TaKaRa	高扩增
Z-Taq ™	TaKaRa	延伸快

4.5. 准备#

新引物使用前离心，1,2000 rpm，2min，加 100× 水稀释（10 mM）

4.5.1. 体系#

	PrimeStar	PrimeStar	®Taq	®Taq	LA Taq EX Taq	LA Taq EX Taq
System	50 μL	20 μL	50 μL	20 μL	50 μL	20 μL
Enzyme	0.5	0.2	0.5	0.2	0.5	0.2
10×Buffer	10	4	5	2	5	2
dNTP Mix	4	1.6	4	1.6	4	1.6
Template	2	0.8	2	0.2	2	0.8
H₂0	31.5	12.6	36.5	15.6	36.5 14.6
Primers	1×2	0.4×2	1×2	0.4×2	1×2	0.4×2

4.5.2. 程序#

Step		温度	时间
1	预变性	94°C	5 min
2	变性	94°C	30 s
3	退火	Tₘ-5°C	30 s
4	延伸	72°C	90 s
5	循环	30∼35°C	cycles
6	后延伸	72°C	5∼10 min

4.5.3. GC Buffer PCR#

System	50	20
LA Taq & PrimeStar	0.5	0.2
GC buffer	25	10
dNTP Mix	4	1.6
Template	2	0.8
H₂O	16.5	6.6
Primers	1×2	0.4×2

GC Buffer 分为 I & II，一般用 I 方可；LA Taq & PrimeStar 有各自的 2×GC Buffer。

5. 琼脂糖凝胶核酸电泳#

双链 DNA 中，碱基处于配对状态，生理条件下，磷酸基带负电，故多聚核苷酸又称多聚阴离子。实际电泳中，由于介质大分子阻力，小分子迁移速率＞大分子，另外迁移速率还与分子构型相关。使用尿素或甲醛等核酸变性剂，可使其打开为单链，此时其电荷多少仅与大小有关。

5.1. 凝胶#

分辨率与凝胶类型和浓度有关

琼脂糖凝胶分辨率为 DNA 0.2-50 kb，丙烯酰胺凝胶分辨率为 DNA 1∼1000 bp。分辨 50 kb 以上的 DNA，需使用脉冲电场凝胶电泳（PFGE）。

5.2. 配胶（1%）#

大胶 0.35 g + 35 mL TAE，小胶 0.15g + 15 mL TAE（pH 试纸检测）
微波炉加热，微沸溶胶至无明显颗粒，室温静置 15 min，稍冷却
在制胶的卡槽上插上梳子，制胶。（卡槽黑色一端为负极）

5.3. 上样（塑料手套上混匀）#

	体积
Marker	2.0 μL（看片段大小）
Loading Buffer	0.5 μL
PCR 产物	2.0 μL（未知浓度可上 5 μL）

目的条带回收

5.4. 双酶切#

产物双酶切

回收后，加入双限制性内切酶，酶切 Buffer 视酶而定，以 Nde I/Xho I 为例

System	50
Nde i	2
Xho I	2
10×H	5
Carrier	30
H₂O	11

50 μL EB 溶解回收目的基因后，约余下 30 μL，可直接操作。若加 BSA 水 H₂O 应减量，37°C 酶切过夜。
酶切后，50 μL 反应液加 50 μL 水
- 60°C，10 min 终止反应
- 加入 500 μL 溶胶液回收酶切片段
质粒双酶切

体系同上，终止时加 Loading Buffer，跑胶回收酶切后片段

5.5. 载体连接#

	Common	T carrier
System	5	10
Segment	3	4.8
Carrier	1	0.2 (T)
T4 ligase	0.5
Buffer	0.5	5 (I)
Reaction
Temperature	20	20
Time	4h or overnight	< 1h
Else		I=segment +T

目的基因若用 Taq 酶扩出，则可连接 T 载体，验证测序正确后进行下一步。

5.6. 菌落验证#

System	50 μL	20 μL
r Taq	0.5 0.2
10×buffer	5	2
dNTP Mix	4	1.6
H₂O	38.5	15.8
PET up/dn	1×2	0.4×2

用牙签挑取单菌落，剩余置于 800 μL LB 中（加抗生素）于 37°C 摇床培养
PCR 体系 20 μL 小管与大管标号一一对应，退火温度 55°C
PCR 产物电泳验证，有目的条带即为阳性克隆，测序正确后提质粒
每个基因挑 10 个克隆，无一正确再挑 10 个

6. 大肠杆菌#

6.1. 非融合表达载体#

A. pKK 223-3 (Pharmacia) B. Pbv220

6.2. 融合表达载体#

SD-ATG 距离固定，翻译起始信号组织合理，表达的蛋白一端有一段细菌多肽或蛋白质。

A. pGEX（Pharmacia）
- 下游 SD 序列为谷胱甘肽巯基转移酶基因，于目的基因相连。
- 由三种不同可读框质粒组成，IPTG 诱导。
- 谷胱甘肽-Sepharose 柱纯化，标签可以凝血酶或凝血因子 X 切除。
B. pRSET（Invitrogen）
- 目的基因插入多克隆位点。由三种不同可读框质粒组成，IPTG 诱导。
- SD 序列和起始密码子下游依次为 His₆ 序列、抗体结合序列、肠激酶识别序列和多克隆位点。
- His₆ 可螯合二价离子，抗体结合部分可供免疫学检测，肠激酶识别部分可以肠激酶切除末端多余肽段。
C. pET（Novagen）
- 目的基因被克隆岛 T7 噬菌体强转录和翻译信号的控制下，并经宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶诱导其表达，目的蛋白可达细胞总蛋白量的 50%。
- 基础表达严格控制，强力表达调控系统。
- 提供可溶蛋白、二硫键生成、蛋白质外运及多肽生产等专用载体和宿主菌。

6.3. 提高表达水平#

改用更强启动子以提高 mRNA 产量，并在基因下游加入稳定 mRNA 的强终止子；
调整 SD-ATG 距离；
改用蛋白酶缺陷型宿主菌，或宿主菌种表达蛋白酶抑制剂，以减少表达蛋白的降解；
改用分泌型表达模式，以减少反馈抑制或蛋白酶降解；
根据密码子简并性，减少目的基因中稀有密码子的比例；
消除核糖体结合位点附近可能的二级结构，加大 A、T 含量，提高翻译效率。

6.4. 菌株选择#

分子生物学实验中的大肠杆菌菌株主要来自 K12（表面糖蛋白 K 抗原）。

	HB101	JM109	DH5α	BL21(DE3)
rec A	-	-	-	+
mrc A	+	-	-	+
mcr BC	-	+	+	+
sup	sup E	sup E	sup E	+
rps	Strʳ	+	+	+
gyr	+	c	Nalʳ	+
Eco K	r⁻m⁻	r⁻m⁺	r⁻m⁺	r⁻m⁻
F’	-	+	-	-
特征	用于一般转化实验	能对 pBlueScrip、pUC 进行蓝白斑筛选	能进行蓝白斑筛选；转化率高	蛋白酶活性低；有 T7 RNA 聚合酶基因

rec A：ATP 依赖型 DNA 重组酶基因缺失，能稳定插入 50 bp 以上重复 DNA 序列，对 DNA 转化有利。
mcr A、mcr BC：特异切割外源 DNA 甲基化序列的限制性内切核酸酶基因，进行高等动植物基因组 DNA 操作时使用其缺失体菌株。
sup E：琥珀突变抑制因子，缺失体不能表达阻遏蛋白与终止密码子 UAG 结合，UAG 将编码成谷氨酰胺。
rps(Strʳ)、gyr(Strʳ)：分别耐 50 μg/mL 链霉素和 100 μg/mL 萘啶酮酸
Eco K：参与限制与修饰。突变株可避免限制反应。
F’ ：具有重组 F 因子，可作 M13 噬菌体的宿主菌。

7. 限制性内切核酸酶#

一类识别 DNA 上 3∼8 个特异核苷酸序列，并产生切割反应的内切核酸酶，广泛分布于细菌细胞中，以防御感染噬菌体。与其识别序列相同，产生修饰作用的酶称修饰酶（主要是甲基化酶）。限制性内切酶自身基因组 DNA 因修饰酶作用而不能被切割，这种防御机制称为限制-修饰系统。

修饰酶活性与限制酶活性分开，反应仅需要 Mg²⁺，有固定识别序列和切割位点，切割位点与识别序列的距离非常接近或完全相同，具有这些特征的限制性内切酶为 II 型限制性内切核酸酶。其多数具有对称的回文结构。大多数酶的最适反应温度是 37°C。

7.1. DNA 甲基化#

dam 甲基酶在 5’ GATC 3’ 的 A 上甲基化，dcm 甲基化酶在 5’ CCAGG 3’ 或 5’ CCTGG 3’ 的 C 上甲基化。

7.2. 星号活力#

酶切反应条件改变后，特异序列识别特性会降低，当酶量占反应体系 1/10 以上，可能导致星号活力。

8. 培养基#

8.1. TB 培养基#

Terrific broth

有机物（900 mL）：胰蛋白胨 12 g，酵母粉 24 g，甘油 4 mL
离子液（100 mL）：0.17 M KH₂PO₄，0.72 M K₂HPO₄
离子液储液：900 mL H₂O，23.1 g KH₂PO₄，164.2 g K₂HPO₄·3H₂O，定容至 1 L

接种 2%，37°C，5 h，OD₆₀₀ = 3.0 时，加入 1‰ 1 M IPTG 诱导

9. 试剂#

9.1. CTAB 提取缓冲液 [1]#

十六烷基三甲基溴化铵

Tris⋅HCl（pH 8.0）提供缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA 螯合 Mg²⁺ 或 Mn²⁺ 离子，抑制 DNase 活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使 DNA 充分溶解，存在于液相中；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组 DNA。

9.2. 焦碳酸二乙酯#

分子式为 C₆H₁₀O₅，分子量为 162.14。是一种强烈但不彻底的 RNase 抑制剂。它通过和 RNAase 的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC 水用于配制电泳缓冲液，和溶解 RNA.每次处理耗材时都要用新配的。有下列毒性：

高效烷化剂，配置：加 0.1% DEPC 到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压 121°C，20 min，DEPC 即降解成 CO₂ 和 H₂O 无毒。
刺激性：对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC 毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。
潜在致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。

9.3. 琼脂糖电泳#

Loading Buffer

先配制 0.1% 溴酚兰水溶液，然后取 1 份 0.1% 溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

TAE 缓冲液（50×）

pH 8.0

每升溶液中含有 242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 M EDTA。电泳时稀释成 1× 浓度使用染色（两层手套，EB 染色 1 min）

溴乙啶染液

称取 5 mg 溴乙啶，用重蒸水溶解定容到 10 mL，取 1 mL 此溶液用 1x TAE 缓冲液稀释到 1 升，最终浓度为 0.5 μg/mL。320 nm 紫外线主要由 EB 吸收，对核酸断链及嘧啶二聚体形成影响小，褪色轻微，观察、操作俱佳。废弃 EB 用 NaClO 处理为无色，倒入水池。