蛋白质生化测定

蛋白质生化测定#

1. 天然蛋白纯化#

1.1. 制备发酵液#

测蛋白活性，同时做对照

接种 20 μL 于 100 mL LB 摇瓶，最适温度，过夜
烧瓶口，倒入 1 L 几丁质摇瓶，最适温度，发酵 4 天
离心（9,000 rpm，5 min），取上清，测蛋白活性

1.2. 取蛋白#

40% 饱和硫酸铵沉淀（113 g/L）
离心（10,000 rpm，10 min）取沉淀，上清保留
最适 pH 透析，换 3 次缓冲液（第一次 15 min）
最适 pH 超滤 3~4 次，浓缩至 < 10 mL，600 mL 时，OD₄₁₀ > 1

1.3. 过层析柱#

2. 细菌重组蛋白纯化#

2.1. 发酵#

接种 10 μL 于 10 mL LB 摇瓶 + 1‰ 卡那霉素 K₅₀（50 mg/mL），37°C 过夜
接种 2% 于 300 mL LB 摇瓶 + 1‰ 卡那霉素 K₅₀，37°C，2 h
OD₆₀₀ = 0.6~0.8 时，加入 1‰ 1 M IPTG 诱导
30°C，12 h

浊度

浊度，又称 OD₆₀₀。在 600 nm 下，形状规则的（近似球形）的微生物菌浓度（干重）和吸光度有线性关系，如细菌、酵母等。

浊度在 0.6∼0.8，表明微生物处于旺盛生长的对数生长期，浊度 > 3 表明微生物已经饱和。

2.2. 取胞内蛋白#

低温离心（6,000 rpm，5 min），取沉淀
加入少量缓冲液 A（20 mM pH 8.0 Tris·Cl + 20 mM 咪唑）
震荡收集菌体于一个离心管中
加冰破壁（工作 3 s，停 4 s，循环 90）
低温离心 2 次（12,000 rpm，5 min），取上清

2.3. 过镍柱#

除上样流速为 0.5 mL/min，其余流速均为 1.0 mL/min

挂镍（50 mM EDTA 15 min，水洗 15 min，0.1 M NiSO₄ 10 min，水洗 10 min）
缓冲液 A（20 mM pH 8.0 Tris·Cl + 0.5 M NaCl + 20 mM 咪唑）平衡 20 min
上样（留 500 μL 用于测蛋白活性及电泳）
缓冲液 A 洗脱至 OD₂₈₀ < 0.1，缓冲液 B（50 mM 咪唑）洗脱至 OD₂₈₀ < 0.05
缓冲液 C 洗脱，自动部分收集 OD₂₈₀ > 0.1 的蛋白
超滤（5,000 rpm，10 min）除盐

2.4. 切标签（带 SUMO 标签）#

透析 20 mM pH 8.0 Tris·Cl + 100~500 μL 过夜
过镍柱，缓冲液 A 洗脱，同时自动收集蛋白
超滤（5,000 rpm，10 min）除盐，最适 pH 稀释，4°C 保藏

3. SDS-PAGE 凝胶电泳#

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）

3.1. 灌胶（两板）#

装板，底边压紧，加水检验
配分离胶（12.5%，A 5 mL，水 4 mL，B 3 mL，D 70 μL，T 15 μL）
每板加入 4.68 mL，以 1 mL 水液封，45 min
配浓缩胶（4.5%，A 0.6 mL，水 2.4 mL，C 1mL，D 30 μL，T 10 μL）
平移均匀加满，插上 10 齿梳子，静置 1 h
缓慢取梳子，卫生纸包好，膜封，娃哈哈水浸润，放入冰箱，一周内使用

3.2. 上样#

装板，将槽倾斜，赶出两板夹缝中的气泡
中间槽中加满 Running Buffer
每个样品 + 4× 处理液（样品体积的 1/3），沸水浴 5 min
边道上 LW Marker 8 μL，样品上 15~30 μL（慢加）
流穿液及其他高盐样品，隔一道上样
红黑电极对准，开机，120 V，400 mA，启动
70 min 后，当样品全部跑出时，关机

3.3. 染色#

刮片开板，将胶两侧沿缝划下，放入小盒
加入少量染色液，摇 20 min
倒去染色液，加入脱色液，微波炉加热 20 s
换脱色液，摇 30 min，换脱色液，直至胶底色完全变白

3.4. 蛋白谱胶电泳注意事项#

配胶时加入 120 μL 乙二醇几丁质（两板）
取胶后，勿染色，加复性剂于 37°C 培养箱中浸泡，1 h 内 3 次
倒去复性剂，加荧光剂，摇 5 min
倒去荧光剂，水洗 1 h

3.5. 配胶缓冲液系统的影响#

制胶缓冲液使用的是 Tris-HCl 缓冲系统，浓缩胶是 pH 6.7，分离胶 pH 8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 Cl⁻ 却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。故，pH 对整个反应体系的影响至关重要，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。

3.6. 样品处理#

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：

还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5 min，再离心加样。
带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100 μL 样品缓冲液中 10 μL 20% 的碘乙酸胺，并在室温保温 30 min。
非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1% SDS 沸水中煮 3 min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3.7. 提高分辨率的途径#

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4°C 冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。

4. 电泳常见问题#

4.1. “微笑”带#

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

4.2. “皱眉”带#

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

4.3. 拖尾#

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

4.4. 纹理#

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

4.5. “鬼带”#

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 β-巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

4.6. 溴酚蓝不能起到指示作用#

溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象，主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。

4.7. 电泳的条带很粗#

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7）；适当降低电压；

4.8. 电泳电压很高，而电流却很低#

这种现象一般初学者易出现。如电压 50 V 以上，可电流却 < 5 mA。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：

a. 内外槽装反； b. 外槽液过少； c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉（如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

4.9. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响#

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

4.10. 凝胶时间不对，或慢或快#

通常胶在 30 min~1 h 内凝。若凝的太慢，可能是 TEMED，APS 剂量不够或失效。APS 应该现配现用，TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。若凝的太快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

4.11. 电泳时间比正常要长#

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 pH 选择错误，即缓冲系统地 pH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

4.12. 分离胶加上后为什么要立即加水#

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

5. 蛋白浓度测定#

5.1. Lowry 法测蛋白含量 [1]#

做标样（5-25 μL）

配制 0.5 mg/mL 牛血清蛋白（称取 0.0050 g + 1 mL，稀释 10 倍）
分别取 0、10、20、30、40、50 μL BSA，分别加水至 200 μL

测标线（平行 2-3 次）

每样加 20 μL 0.15% 脱氧乙酸（DOC），10 min（去干扰离子）
每样加 20 μL 72% 三氯乙酸（TCA），离心（10,000 rpm，10 min）
甩去液体，每样加入 200 μL CTC 工作液（现配，2.8 mL），10 min
每样加 100 μL 20% Folin-酚（现配），30 min
测 OD₇₅₀

CTC 储存液

0.2 g 无水硫酸铜 + 0.2 g 酒石酸钾，溶于 100 mL
缓慢加入 100 mL 20% Na₂CO₃（20 g）

CTC 工作液（水、0.8 M NaOH、10% SDS、CTC 储存液，等体积混合）

5.2. Bradford 法测蛋白含量 [2]#

做标样（10∼50 μL）

配制 1 mg/mL 牛血清蛋白（称取 0.0010 g + 1 mL）
分别取 0、10、20、30、40、50 μL BSA，分别加水至 100 μL

做标线

每样加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，翻转数次，3~5 min
测 OD₅₉₅

测定

称取 20 mg 考马斯亮蓝 G-250 颗粒 + 10 mL 95% 乙醇
加 20 mL 85% 以上磷酸，摇匀，定容至 200 mL