糖生化测定

糖生化测定#

1. 分糖#

1.1. 预备#

  1. 收集管以清水冲洗，后以去离子水浸泡

  2. 称取寡糖 1~2 g 配成 10% 的溶液

  3. 上样，紫外测定

1.2. 收集#

  1. 以 1 mL/min 流速，每 10 min 收集 1 管

  2. 取紫外吸收峰交叠处，点 TLC 验证纯度

  3. 取较纯部分悬蒸，50°C，2~3 h/500 mL，至 20 mL 以内。

  4. 平放，冷冻于 -80°C

  5. 在三角瓶上封膜，在膜上扎眼，冻干，冷冻保存。

1.3. 壳寡糖的分离#

  1. 制备 1% 的壳聚糖溶液（将 1g 壳聚糖溶于 100 mL 1% 的醋酸，后用 NaOH 调 pH 至 5.0）

  2. 取 100 mL 溶液 + 0.5 U 壳聚糖酶 + 1 U 几丁质酶 + 2 U NAGase，30°C，8h。

  3. 将溶液 pH 调至 8.0，旋蒸后，过膜除沉淀。

  4. 上活性炭柱，测定 OD₂₂₀

2. 糖检测与分析#

2.1. 薄层层析#

2.2. 制板#

  1. 背面 10 cm 处取两点划线，裁下，不断轻微翻折至两部分断开

  2. 底线距底边 1.5 cm，其上每隔 0.6 cm 取点，每点上样 5~10 μL，进样针点样

2.3. 展层#

  1. 在展层槽中加入展层剂，其里面低于硅胶板样品线

  2. 放入展层，展完后（约 40 min），吹干，再展，展完再吹干

  3. 迅速插入入装有染色剂的液槽中，吹干

  4. 烘箱加热至显色（10 min）

2.4. 显色剂与展层剂#

检测产物

展层剂

显色剂

参考文献

壳寡糖

异丙醇：水：氨水
70:30:5

5‰ 茚三酮乙醇溶液

几丁寡糖

正丁醇：甲醇：氨水：水
5:4:2:1

甲醇：浓硫酸
95:5

2.5. TLC 拖尾现象#

  1. 样品浓度过大，薄层板过载导致。这种情况直接降低样品浓度或是上样量就可以验证了。

  2. 样品对硅胶的吸附能力过强导致的拖尾。对不同体系加入不同的调节剂，酸体系加冰醋酸，碱体系加氨水。

  3. 展开剂的极性与样品极性不附，不能做到有效展开导致。可以通过调节展开剂极性解决。

  4. 若是长带状，那最可能的原因是展开剂对样品的溶解度不够所导致。可以根据极性表换极性相近的对样品溶解度更好的溶剂做展开剂。

  5. 硅胶板是有酸性的，分子中有 -NH 或 -N- 的化合物显碱性，用硅胶板做 TLC 的时候会拖尾

  6. 展开剂中加三乙胺或氨水，可以使硅胶板的酸性中和，就不会拖尾了，一般做碱性物质的 TLC 都加氨水或三乙胺

2.6. 其他问题#

  • 展样不齐：桌面不平；硅胶板未放平；硅胶板上下不平行（裁板问题）；

  • 背景色深、显色难：样品杂质多（可用阴阳离子树脂吸附）；显色剂过久（硫酸中混有过多水分等）；展层剂过久混有杂质；展层剂未及时吹干。

3. 酶活#

3.1. 几丁质酶及壳聚糖酶 [1]#

  1. 底物震荡，剪枪头

  2. 底物（sigma 胶体几丁质，质量分数 ca. 1%）200 μL

  3. 酶液 200 μL

  4. 水浴 50°C，30 min

  5. 加入 DNS 600 μL，沸水浴 10 min

  6. 简单离心，测 OD₅₄₀

3.2. β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 [2]#

  1. 底物（2 mM _p_NP-β-乙酰葡萄糖胺）100 μL

  2. 缓冲液（20 mM pH 6.5 磷酸盐）稀释酶液 100 μL

  3. 水浴 40°C，10 min

  4. 加入 0.5 M NaOH 200 μL 终止反应

  5. 测 OD₄₁₀

4. 酶学性质#

4.1. pH#

  1. 最适 pH：于最适温度下，以不同 pH 缓冲液将酶液稀释 100 倍以上，采用标准方法测定酶活。

  2. pH 稳定性：于最适温度下，以不同 pH 缓冲液将酶液稀释 100 倍以上，保温 30 min，冰水浴 30 min，再于最适条件下（调回最适 pH）测定酶活

4.2. 温度#

  1. 最适温度：于最适 pH 下，以不同温度水浴，采用标准方法测定酶活。

  2. 温度稳定性：于最适 pH 下，以不同温度水浴处理 30 min，冰浴 30 min，再于最适条件下测定酶活。

4.3. 半衰期#

设酶失活为一级不可逆失活，酶失活符合一级失活模型，则时间与酶活浓度的关系满足下列方程：

\[ [E_t] = [E₀]\exp(-k_dt) \]

多数酶的热失活服从上式，\(k_d\)可称为衰变常数，单位为\(t^{-1}\)。\(k_d\)的倒数称为时间常数\(t_d\)。当\([E_t]\)为\([E₀]\)的一半的时间称为半衰期，用\(t_{\frac{1}{2}}\)表示。

\(k_d\)、\(t_d\)和\(t_{\frac{1}{2}}\)之间的关系为：

\[ k_d = 1/t_d = \ln2 / t_{\frac{1}{2}} \]

取一定量的酶液，在热稳定转变温度下，保温一定时间（0，15，30，60，120，240 min）后迅速冷却。测定残余活力，以保温前的酶活力为 100%，以相对残余酶活取自然对数为纵坐标，时间为横坐标作图。得标准曲线，以之求取半衰期。

4.4. 分子量#

在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质－SDS 复合物，这种复合物由于结合了大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

当蛋白质的分子量在 15,000~200,000 之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：

\[ \log{M_r} = - b ⋅ m_R + K \]

其中，\(M_r\)为蛋白质分子量，\(m_R\) 为相对迁移率，等于样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）。在条件一定时，b 和 K 均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

5. 培养基#

5.1. 几丁质平板（1L）#

  1. 离子液：K₂HPO₄ 0.7g，KH₂PO₄ 0.3g，KCl 0.5g，MgSO₄ 0.5g

  2. 有机物：蛋白胨 5g，琼脂 15g，胶体几丁质

5.2. 胶体几丁质#

  1. 10g 几丁质粉末 + 100 mL 浓盐酸，阴暗处静置过夜

  2. 200 mL 50% 乙醇分次加入，使胶体几丁质析出

  3. 9,000 rpm，3 min，取沉淀

  4. 水洗至 pH=7

6. 试剂#

6.1. 3,5-二硝基水杨酸（DNS）#

  1. 配制 100 mL 5 M NaOH（20 g），加入 DNS 粉末 3.15 g，加水至 500 mL。

  2. 水浴至 45°C，同时不断搅拌，直至溶液清澈透明。

  3. 依次加入四水酒石酸钾钠 91.0 g，苯酚 2.50 g，无水亚硫酸钠 2.50 g。继续 45°C 水浴加热，同时加水至 800 mL，不断搅拌，至完全溶解。

  4. 停止加热，冷却至室温后，用水定容至 1000 mL。

  5. 烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放 7 天后使用，有效期为 6 个月。

7. 参考文献#